肾脏器官移植是终末期肾脏疾病的最理想治疗方法。但是肾脏器官移植过程中无法避免缺血再灌注损伤，而且在移植肾脏后期和长期功能改变中均发挥重要影响。另外，来自心脏死亡供体的器官要面临冷缺血时间危及移植后肾脏存活的潜在危险因素。冷缺血时间12小时以内是移植肾脏存活的关键，但是大多数心脏死亡供体的器官都超过这个冷缺血时间。器官缺血时能量物质供应和需求不平衡导致组织缺氧和微血管功能异常，再灌注进一步增强固有/适应性免疫反应和细胞死亡过程。因此，优化体外器官保护手段能减少缺血再灌注损伤、提高移植器官存活率和长期治疗效果。

缺血再灌注引起肾脏器官损伤的主要因素之一是毒性氧自由基的产生，毒性氧自由基过度产生可以导致DNA受损、蛋白氧化和硝基化、脂质过氧化、细胞凋亡等细胞损伤。最近Ohsawa等证明氢气通过减少细胞毒性氧自由基对脑缺血再灌注损伤产生保护作用。Shingu等证明静脉注射氢气饱和生理盐水可减轻大鼠肾脏缺血再灌注损伤。早期的研究发现，添加气体可以改进器官保护液功能。Nakao等证明一氧化碳溶解在威斯康星大学溶液中可保护大鼠心脏冷缺血再灌注损伤。本研究假设威斯康星大学溶液中溶解氢气可以保护肾脏冷缺血再灌注损伤。

研究结果

1、制备氢气器官保护液

这个研究提供了一种新型的氢气溶解方法（技术模拟图(Fig. 1A) MiZ Co., Ltd., Kanagawa, Japan，曾有人使用这个技术制备给人注射用的氢气饱和生理盐水）。他们用灌满器官保护液的离心管浸泡在氢气饱和溶液中，温度保持在5度，氢气从氢气饱和溶液（1.60 mg/L）通过管壁扩散到灌满器官保护液，48小时后保护液中氢气浓度可以达到1.32 mg/L(Fig. 1B)。然后把肾脏放入离心管，随后将该离心管继续浸泡在5度氢气饱和溶液中24小时，氢气浓度仍可以达到1.39 mg/L（和放肾脏前1.32 mg/L无统计学差异(Fig. 1C)）。在溶解氢气的同时，不影响器官保护液内的氧气浓度（9.6 ±0.3vs. 9.5 ±0.4 mg/L，注意：这一点特别重要，如果采用氢气加压的技术，氧气的浓度必然显著下降）。

2、移植肾脏存活和肾脏功能改变

三组动物：直接移植（无冷缺血）、UW（无氢气保护液）冷缺血组和HRUW（氢气保护液）冷缺血组。不同冷缺血时间：24小时、36小时和48小时。存活100天结果发现，无冷缺血组动物肾脏全部存活1， 24小时冷缺血组UW和HRUW无统计学区别（78.6% vs. 100%,）。36小时冷缺血组HRUW存活66.7%，远超过UW的20.0%。48小时冷缺血组UW和HRUW无统计学区别。（这个设计非常值得学习，我们一般在进行设计的时候，往往是希望所有的指标整齐划一，但在实际情况下，由于损伤程度不同，损伤太少的，看不到死亡率的区别，死亡太大的，看不到治疗效果的差别，死亡率有明显区别，机制研究带来灾难。作者进行三种不同程度的区分，只发现36小死亡率的统计学改变，不影响进行后续的深入研究，精彩的在后面）。

尽管24小时没有死亡率的统计学差异（其实78.6% vs. 100%,也不错，只要增加动物样本数量，相信同样可以有统计学差异的），作者对这一组动物进行了肾脏功能的检测，他们是在肾脏移植后90天进行的检测。结果发现。肌苷、肌苷清除率和24小时蛋白尿等指标HRUW都显著优于UW。说明氢气饱和保护液对长期的移植后肾脏功能影响是显著的（这个处理非常聪明）。

3、氢气保护液可以减少移植肾小管损伤和间质纤维化

前面的研究提示氢气保护液可以对24小时冷缺血后的移植肾长期功能产生明显的保护。随后他们对移植肾100天后的组织形态学进行了检测，主要观察到肾小管萎缩、扩张、刷状缘丢失、炎症细胞浸润和管型形成等。和普通的保护液相比，氢气保护液可以显著减少肾小管上述损伤（损伤评分下降）。间质纤维化用马森三色染色定量，结果发现氢气保护液可以显著改善间质纤维化。

4、氢气保护液可以减少氧化损伤（特别注意动物分组和取材的时间点）

氢气生物学效应研究总无法排除氧化损伤的效应观察。随后作者对冷缺血36小时移植后3小时的移植肾脏组织MDA和血清中8羟基鸟嘌呤，结果发现移植肾脏组织MDA在氢气保护液组明显低于普通保护液组53.8 [14.3] vs. 37.7 [7.3] KM/g。但血清中8羟基鸟嘌呤无显著性改变0.34[0.08] vs 0.29 [0.03]mg/L,P=0.524。

5、氢气保护液对肾小管细胞碉亡和间质巨噬细胞浸润的影响

因为氢气保护液可降低氧化损伤，随后作者对肾小管细胞碉亡和间质巨噬细胞浸润。这个实验是冷缺血36小时，移植后24小时取材（注意：这样的设计决定于观察指标细胞碉亡巨噬细胞浸润）。Tunel和ED-1免疫组织化学分别作为细胞碉亡和巨噬细胞浸润的观察指标）。研究结果显示，氢气饱和保护液的效果超过普通的保护液。（这个研究可说明为什么氢气可以增加存活率是因为减少了早期24小时的细胞碉亡和炎症反应。当然，Tunel也不是单显示细胞碉亡，这里无法排除细胞死亡的情况，甚至死亡更多更重要。）

6、基因表达和蛋白水平的研究

（为了使研究达到分子水平，总需要这样的点缀。）这个内容取材同实验5，也是冷缺血36小时，移植手术后24小时取肾脏组织。定量PCR结果显示，干扰素g、白细胞介素6、肿瘤坏死因子a、血红素加氧酶1的mRNA没有改变（尽管显著高于正常组织）。不过趋化因子(C-C基元)配体2、诱导型一氧化氮合酶的mRNA都显著下降，趋于正常。诱导型一氧化氮合酶的Western Blot结果符合mRNA的改变。

讨论

1、氢气可用于潜水作业，因此相当安全。

尽管容易爆炸，但浓度只要不超过4.7%就不燃烧，自从Ohsawa发现氢气可以中和自由基治疗脑缺血后，氢气治疗各类疾病成为研究热点。

2、氢气可以呼吸，已经证明呼吸氢气可治疗许多疾病。但呼吸的方法不方便日常使用，难以连续使用。喝氢气饱和水是个办法，研究也证明效果不凡。但喝水不容易确定剂量，给研究带来一定麻烦。于是就有人开展注射氢气盐水，效果确实不错。氢气溶解的方法有通过加压处理、通气泡溶解的方法。我们的研究提供了一个新的技术，可以不影响包装内成分的前提下制备出氢气饱和溶液。这个方法作氢气水牛，他们称为“非破坏性溶解氢气技术”。因为不需要打开包装，可对目前使用的临床制剂进行加氢气处理，不会使处理的溶液发生成分或微生物污染，就可以进入临床使用（广告？）。

3、本研究首先评价了氢气保护液可更加有效地保护体外保护器官。其作用可能是具有抗氧化作用。其中特别注意的是可降低iNos这样可能具有抗硝基化的作用。

基因蛋白表达的结果显示该保护液体具有抗早期炎症的作用，虽然对一些因子的改变没有明显改善，但对巨噬细胞相关的炎症因子改变显著，这正好符合巨噬细胞浸润的结果。

研究中发现尽管器官移植后HO-1 mRNA增加，但氢气没有使之下降，说明这个模型中的效应和HO-1没有关系。（不过只测定mRNA，没有蛋白和活性的分析，这个结论不够严格。）

总之，这个研究发现，将氢气溶解在器官保护液中，可以提高保护效果，主要是通过减少氧化损伤、降低炎症反应，减少早期细胞坏死和间质纤维化，从而对移植肾脏的产生明显的长期保护效果。